PCR
Bách khoa toàn thư mở Wikipedia
PCR là chữ viết tắt của cụm từ Polymerase Chain Reaction, được dịch ở một vài sách là Phản ứng chuỗi trùng hợp. PCR là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm khuyếch đại (tạo ra nhiều bản sao) một đoạn DNA mà không cần sử dụng các sinh vật sống như E. coli hay nấm men. PCR được sử dụng trong các nghiên cứu sinh học và y học phục vụ nhiều mục đích khác nhau, như phát hiện các bệnh di truyền, nhận dạng vân tay DNA, chuẩn đoán những bệnh nhiễm trùng, tách dòng gene, và xác định huyết thống.
Mục lục |
[sửa] Lịch sử
Phương pháp căn bản chạy PCR được Kary Mullis phát minh, ông đã đoạt giải Nobel về Hóa học vào tháng 10 năm 1993 cho thành tựu này, chỉ sau 7 năm khi ông đưa ra ý tưởng. Ý kiến của Mullis là phát triển một quy trình mà DNA có thể nhân lên nhiều lần một cách nhân tạo qua nhiều chu kỳ sao chép bởi enzyme DNA polymerase.
DNA polymerase có tự nhiên trong sinh vật sống, nơi mà nó thực hiện chức năng nhân DNA khi tế bào phân chia. Nó làm việc bằng cách nối với sợi DNA và tạo sợi bổ sung. Theo quy trình PCR gốc của Mullis, enzyme phản ứng nhân bản DNA được thực hiện trong ống nghiệm (in vitro). Sợi DNA đôi bị tách thành 2 sợi đơn khi đun nóng ở 96°C. Tuy nhiên, ở nhiệt độ này DNA polymerase bị phá hủy vì vậy cần bổ sung enzyme sau mỗi giai đoạn nung nóng của mỗi chu kỳ. Quy trình PCR gốc của Mullis không có hiệu quả cao vì nó mất nhiều thời gian, cần một lượng lớn DNA polymerase, và phải liên tục lưu ý suốt trong quá trình PCR.
Sau đó, quy trình gốc này được phát triển bằng cách dùng DNA-Polymerase lấy từ vi khuẩn thermophilic (ưa nhiệt) sống trong mạch nước phun ở nhiệt độ trên 110°C. DNA polymerase từ sinh vật này là thermostable (ổn định ở nhiệt độ cao) và khi dùng trong PCR nó không bị phá vỡ khi hỗn hợp được nung nóng để tách sợi DNA. Từ đó, không cần phải them DNA-polymerase vào mỗi chu kỳ, quá trình sao chép DNA có thể đơn giản và tự động hơn.
Một trong những DNA-polymerase chịu nhiệt đầu tiên được phân lập được từ Thermus aquaticus và được gọi là Taq. Taq polymerase được dùng rộng rãi trong thực nghiệm PCR (5/2004). Nhược điểm của Taq là thỉnh thoảng nó nhầm lẫn trong quá trình sao chép DNA, dẫn đến đột biến (sai) trong chuỗi DNA, vì nó thiếu tính sửa sai exonuclease 3’-5’. Các polymerase như Pwo hay Pfu, được phân lập từ Archaea có cơ chế sửa sai (cơ chế kiểm tra lỗi sai) và có thể làm giảm một cách đáng kể số đột biến xảy ra trong chuỗi DNA được sao chép. Ngày nay, sự kết hợp giữa Taq và Pfu có thể cung cấp cả độ tin cậy cao lẫn sự nhân bản chính xác của DNA.
[sửa] Vấn đề bản quyền của kỹ thuật PCR
The PCR technique was patented by Cetus Corporation, where Mullis worked when he invented the technique. The Taq polymerase enzyme is also covered by patents. There have been several high-profile lawsuits related to the technique, including most famously a lawsuit brought by DuPont. The pharmaceutical company Hoffmann-La Roche purchased the rights to the patents in 1992 and currently holds them.
[sửa] Thực nghiệm PCR
PCR được dùng để khuếch đại một đoạn DNA ngắn, đã xác định được một phần. Đó có thể là một gen đơn, hay một phần của gen. Trái với sinh vật sống, quy trình PCR có thể copy một mảnh DNA ngắn, có thể lên đến 10kb (kb= kilo cặp base=1000 cặp base). DNA là một sợi đôi, và vì vậy nó được đo với DNA bổ sung … gọi là cặp base. Một vài phương pháp có thể copy một mảnh kích thuớc lên đến 40kb ít hơn nhiều so với nhiễm sắc thể DNA trong tế bào eukaryote – ví dụ như tế bào người chứa hơn 3 tỉ cặp base.
Như đã thực hành hiện nay, PCR cần rất nhiều thành phần. Những thành phần đó là: - DNA mẫu chứa mảnh DNA cần khuếch đại - cặp mồi, để xác định điểm bắt đầu và kết thúc vùng cần khuếch đại (xem phần tiếp theo về mồi) - DNA-polymerase để copy vùng cần khuếch đại - Nucleotides từ DNA-polymerase để xây dựng DNA mới. - Dung dịch đệm, cung cấp môi trường hóa học cho DNA-polymerase
Phản ứng PCR được thực hiện trong chu kỳ nhiệt. Đây là máy đun nóng và làm nguội trong ống phản ứng ở nhiệt độ chính xác cho mỗi phản ứng. Để ngăn ngừa sự bay hơi của hỗn hợp phản ứng, một cái nắp được đun nóng được đặt trên nắp phản ứng hay một lớp dầu được đặt trên bề mặt hỗn hợp phản ứng. Năm 2004, giá máy khoảng 2500 USD.
[sửa] Đoạn mồi
Mảnh DNA cần khuếch đại được xác định bằng mồi chọn lọc. Mồi là những đoạn ngắn, sợi DNA nhân tạo – không quá 50 (thường 18-25bp) nucleotides (vì DNA thường là sợi đôi, chiều dài của nó được xác định bằng cặp base; chiều dài của sợi đơn DNA được đo bằng base hay nucleotides) phù hợp một cách chính xác ở điểm bắt đầu và kết thúc của DNA cần khuếch đại. Nó gắn chặt với DNA mẫu ở những điểm khởi đầu và kết thúc, nơi mà DNA-polymerase nối và bắt đầu quá trình tổng hợp của sợi DNA mới.
Sự lựa chọn về chiều dài của những đoạn mồi và nhiệt độ nóng chảy của nó (Tm) phụ thuộc vào số … Nhiệt độ nóng chảy của mồi – đừng nhầm lẫn với nhiệt độ nóng chảy của DNA trong chu kỳ đầu tiên của quá trình PCR -- được định nghĩa là nhiệt độ dưới lúc mồi bám vào DNA mẫu và nhiệt độ trên lúc mồi tách ra khỏi DNA mẫu. Nhiệt độ nóng chảy tỉ lệ thuận với chiều dài đoạn mồi. Mồi quá ngắn sẽ bám nhiều vị trí trên DNA mẫu dài và sẽ cho kết quả không rõ ràng. Mặt khác chiều dài DNA bị giới hạn bởi nhiệt độ cần nóng chảy. Nhiệt độ nóng chảy quá cao, ví dụ như trên 80oC sẽ gây ra nhiều vấn đề vì DNA-polymerase hoạt động kém ở nhiệt độ đó. Chiều dài tốt nhất của đoạn mồi là từ 20-40 nucleotide với nhiệt độ nóng chảy khoảng từ 60 – 750C.
Thỉnh thoảng những đoạn mồi đã thoái hóa cũng được sử dụng. Những đoạn mồi này là hỗn hợp tương tụ nhưng không giống hoàn toàn. Nó có thể thuận tiện nếu có cùng gen cần khuếch đại từ những sinh vật khác nhau, như bộ gen của nó có thể là tương tự nhưng không giống nhau. Người ta còn dùng những đoạn mồi đã thoái hóa khi mồi được thiết kế dựa trên chuỗi protein. Như nhiều codon có thể mã hóa cho nhiều acid amin, thường rất khó để suy ra codon nào dùng cho trường hợp đặc biệt. Vì vậy đoạn mồi tương ứng với axit amin isoleucine có thể là “ATH”, A có nghĩa là adenine, T là thymine, và H ứng với adenine, thymine, hay cytosine. (Xem mã di truyền để hiểu them về codons) Sử dụng đoạn mồi đã thoái hóa có thể làm giảm đặc trưng của phản ứng khuếch đại PCR. Vấn đề có thể được giải quyết bằng phương pháp touchdown PCR.
Vấn đề thiết kế mồi chính xác đã được đề cập ở trên cần phụ thuộc vào sản xuất sản lượng: - hàm lượng GC nên trong khoảng 40-60 - Tính toán nhiệt nóng chảy cho cả những đoạn mồi trong phản ứng không khác quá 50C và nhiệt nóng chảy của sản phẩm khuếch đại không khác mồi quá 100C - Nhiệt độ bám vào thỉnh thoảng thấp hơn nhiệt nóng chảy 50C. Tuy nhiên, nên chọn lựa theo kinh nghiệm cho từng trường hợp cụ thể. - Tránh … - Kết thúc đầu 3’ rất nhạy cảm – nó có thể không bổ sung cho bất cứ vùng nào của đoạn mồi trong phản ứng và phải cung cấp base chính xác phù hợp với mẫu. Có cả chương trình giúp thiết kế mồi (xem External links)
[sửa] Quy trình
Quy trình PCR gồm 20 đến 30 chu kỳ. Mỗi chu kỳ gồm 3 bước (Hình 2) (1)Nhiệt độ tăng lên 94-960C để tách hai sợi DNA ra. Bước này gọi là nóng chảy, nó phá vỡ cầu nối hygrogen nối 2 sợi DNA. Trước chu kỳ 1, DNA DNA thường được nấu chảy đến thời gian mở rộng để đảm bào mẫu DNA và mồi được phân tách hoàn toàn và chỉ sòn sợi đơn. Thời gian: 1-2 phút
(2)Sau khi 2 sợi DNA tách ra, nhiệt độ được hạ thấp xuống để mồi có thể gắn vào sợi DNA đơn. Bước này gọi là gắn dính. Nhiệt độ giai đoạn này phụ thuộc vào đoạn mồi và thường thấp hơn nhiệt nóng chảy 50C (45-600C). Nhiệt độ sai trong giai đoạn này dẫn đến đoạn mồi không gắn hoàn toàn vào DNA mẫu, hay gắn một cách tùy tiện. Thời gian: 1-2 phút.
(3) Cuối cùng, DNA polymerase lắp vào sợi trống. Nó bắt đầu bám vào và làm việc dọc theo sợi DNA. Bước này gọi là kéo dài. Nhiệt độ kéo dài phụ thuộc DNA-polymerase. Thời gian của bước này phụ thuộc vào cả DNA-polymerase và chiếu dài mảnh DNA cần khuếch đại. Như một quy tắc …, 1000bp/ 1 phút.
[[image:pcr.png|frame|none|Figure 2: Hình 2: Chu trình PCR dưới dạng sơ đồ. (1) Nóng chảy ở 960C. (2)Gắn dính ở 680C. (3)Kéo dài ở 720C (P=Polymerase). (4)Chu trình đầu tiên hoàn thành. Hai sợi DNA kết quả thành DNA mẫu cho chu trình kế tiếp, mặc dù gấp đôi lượng DNA bản sao cho mỗi chu kỳ.
[sửa] Ví dụ
Thời gian và nhiệt độ trong ví dụ này được lấy từ chương trình PCR mà đã thành công trên phân đoạn 250bp của đầu C của insulin-like growth factor (IGF).
Hỗn hợp phản ứng gồm:
- 1.0 µl DNA khuôn (100 ng/µl)
- 2.5 µl mồi, 1.25 µl cho mỗi mồi(100 ng/µl)
- 1.0 µl Pfu-Polymerase
- 1.0 µl nucleotide
- 5.0 µl đệm
- 89.5 µl H2O
Trong ống phản ứng 200 µl chứa 100 µl hỗn hợp được đưa vào thermocycler.
Quy trình PCR bao gồm các bước sau:
- Bước 1
- Khởi đầu. Đun hỗn hợp ở 96°C trong vòng 5 phút để đảm bảo sợi DNA cũng như mồi được đun. DNA-Polymerase có thể có trong giai đoạn khởi đầu, hoặc nó có thể được thêm vào sau ngay sau bước này.
- Bước 2
- Melting. Heat at 96°C for 30 seconds. For each cycle, this is usually enough time for the DNA to melt.
- Step 3
- Annealing. Heat at 68°C for 30 seconds.
- Step 4
- Elongation. Heat at 72°C for 45 seconds.
- Step 5
- Steps 2-4 are repeated 25 times, but with good primers and fresh polymerase, 15 to 20 cycles is sufficient.
- Step 6
- Hold mixture at 7°C. This is useful if one starts the PCR in the evening just before leaving the lab, so it can run overnight. The DNA will not be damaged at 7°C after just one night.
The PCR product can be identified by its size using agarose gel electrophoresis. Agarose gel electrophoresis is a procedure that consists of injecting DNA into agarose gel and then applying an electric current to the gel. As a result, the smaller DNA strands move faster than the larger strands through the gel toward the positive current. The size of the PCR product can be determined by comparing it with a DNA ladder, which contains DNA fragments of known size, also within the gel (Fig. 3).
[sửa] Tối ưu hoá PCR
Since PCR is very sensitive, adequate measures to avoid contamination from other DNA present in lab environment (bacteria, viruses, own DNA etc.) should be taken. Thus DNA sample preparation, reaction mixture assemblage and the PCR process, in addition to the subsequent reaction product analysis, should be performed in separate areas. For the preparation of reaction mixture, a laminar flow cabinet with UV lamp is recommended. Fresh gloves should be used for each PCR step as well as displacement pipettes with aerosol filters. The reagents for PCR should be prepared separately and used solely for this purpose. Aliquots should be stored separately from other DNA samples. A control reaction (inner control), omitting template DNA, should always be performed, to confirm the absence of contamination.
[sửa] Recent developments in PCR techniques
- A more recent method which excludes a temperature cycle, but uses enzymes, is helicase-dependent amplification.
- A style of PCR that reduces nonspecific primer annealing is Touchdown PCR.
- Real-Time PCR is a quantative PCR technique.
[sửa] Những ứng dụng của PCR
PCR can be used for a broad variety of experiments and analyzes. Some examples are discussed below.
[sửa] Vân tay di truyền
Genetic fingerprinting is a forensic technique used to identify a person by comparing his or her DNA with a given sample, e.g., blood from a crime scene can be genetically compared to blood from a suspect. The sample may contain only a tiny amount of DNA, obtained from a source such as blood, semen, saliva, hair, etc. Theoretically, just a single strand is needed. First, one breaks the DNA sample into fragments, then amplifies them using PCR. The amplified fragments are then separated using gel electrophoresis. The overall layout of the DNA fragments is called a DNA fingerprint.
[sửa] Kiểm tra huyết thống
Although these resulting 'fingerprints' are unique (except for identical twins), genetic relationships, for example, parent-child or siblings, can be determined from two or more genetic fingerprints, which can be used for paternity tests (Fig. 4). A variation of this technique can also be used to determine evolutionary relationships between organisms.
[sửa] Chẩn đoán bệnh di truyền
The detection of hereditary diseases in a given genome is a long and difficult process, which can be shortened significantly by using PCR. Each gene in question can easily be amplified through PCR by using the appropriate primers and then sequenced to detect mutations.
Viral diseases, too, can be detected using PCR through amplification of the viral DNA. This analysis is possible right after infection, which can be from several days to several months before actual symptoms occur. Such early diagnoses give physicians a significant lead in treatment.
[sửa] Tách dòng gene
Cloning a gene--not to be confused with cloning a whole organism--describes the process of isolating a gene from one organism and then inserting it into another organism. PCR is often used to amplify the gene, which can then be inserted into a vector (a vector is a means of inserting a gene into an organism) such as a plasmid (a circular DNA molecule) (Fig. 5). The DNA can then be transferred into a different organism where the gene and its product can be studied more closely. Expressing a cloned gene (to express a gene means to produce the protein that it determines the production of) can also be a way of mass-producing useful proteins--for example, medicines.

(1) Chromosomal DNA of organism A. (2) PCR. (3) Multiple copies of a single gene from organism A. (4) Insertion of the gene into a plasmid. (5) Plasmid with gene from organism A. (6) Insertion of the plasmid in organism B. (7) Multiplication or expression of the gene, originally from organism A, occurring in organism B.
[sửa] Gây đột biến điểm
Mutagenesis is a way of making changes to the sequence of nucleotides in the DNA. There are situations in which one is interested in mutated (changed) copies of a given DNA strand, for example, when trying to assess the function of a gene or in in-vitro protein evolution. Mutations can be introduced into copied DNA sequences in two fundamentally different ways in the PCR process. Site-directed mutagenesis allows the experimenter to introduce a mutation at a specific location on the DNA strand. Usually, the desired mutation is incorporated in the primers used for the PCR program. Random mutagenesis, on the other hand, is based on the use of error-prone polymerases in the PCR process. In the case of random mutagenesis, the location and nature of the mutations cannot be controlled. One application of random mutagenesis is to analyze structure-function relationships of a protein. By randomly altering a DNA sequence, one can compare the resulting protein with the original and determine the function of each part of the protein.
[sửa] Phân tích mẫu DNA cổ
Using PCR, it becomes possible to analyze DNA that is thousands of years old. PCR techniques have been successfully used on animals, such as a forty-thousand-year-old mammoth, and also on human DNA, in applications ranging from the analysis of Egyptian mummies to the identification of a Russian tsar.
[sửa] Xác định kiểu gene của các đột biến
Through the use of allele-specific PCR, one can easily determine which allele of a mutation or polymorphism an individual has. Here, one of the two primers is common, and would anneal a short distance away from the mutation, while the other anneals right on the variation. The 3' end of the allele-specific primer is modified, to only anneal if it matches one of the alleles. If the mutation of interest is a T or C single nucleotide polymorphism (T/C SNP), one would use two reactions, one containing a primer ending in T, and the other ending in C. The common primer would be the same. Following PCR, these two sets of reactions would be run out on an agarose gel, and the band pattern will tell you if the individual is homozygous T, homozygous C, or heterzygous T/C. This methodology has several applications, such as amplifying certain haplotypes (when certain alleles at 2 or more SNPs occur together on the same chromosome [Linkage Disequilibrium]) or detection of recombinant chromosomes and the study of meiotic recombination.
[sửa] So sánh mức độ biểu hiện của gene
Researchers have used traditional PCR as a way to estimate changes in the amount of a gene's expression. Ribonucleic acid (RNA) is the molecule into which DNA is transcribed prior to making a protein, and those strands of RNA that hold the instructions for protein sequence are known as messenger RNA (mRNA). Once RNA is isolated it can be reverse transcribed back into DNA (complementary DNA to be precise, known as cDNA), at which point traditional PCR can be applied to amplify the gene, this methodology is called RT-PCR. In most cases if there is more starting material (mRNA) of a gene then during PCR more copies of the gene will be generated. When the product of the PCR reaction are run on an agarose gel (see Figure 3 above) a band, corresponding to a gene, will appear larger on the gel (note that the band remains in the same location relative to the ladder, it will just appear fatter or brighter). By running samples of amplified cDNA from differently treated organisms one can get a general idea of which sample expressed more of the gene of interest. A quantative RT-PCR method has been developed, it is called Real-Time PCR.
[sửa] Các liên kết ngoài
- Cẩm nang kỹ thuật PCR trên thư viện khoa học VLOS.
- Primer Prediction and Analysis programs A website detailing some free software for primer design
- - The reference in real-time PCR
Các ngành của sinh học |
---|
Giải phẫu học | Sinh học vũ trụ | Hóa sinh | Tin sinh học | Thực vật học | Tế bào học | Sinh thái học | Sinh học phát triển | Di truyền học | Sinh học biển | Sinh học người | Vi sinh vật học | Sinh học phân tử | Nguồn gốc sự sống | Cổ sinh vật học | Miễn dịch học | Sinh lý học | Phân loại học | Động vật học | Trang chính Sinh học |